Gentechnik: Hybridisierungsverfahren

Gentechnik: Hybridisierungsverfahren

 

Für den Nachweis spezifischer DNA-Abschnitte sind neben der Polymerasekettenreaktion die Hybridisierungsverfahren sehr wichtig. Das Prinzip bei der Hybridisierung besteht darin, dass zwei zueinander komplementäre Nukleinsäurestränge einen relativ stabilen Doppelstrang bilden.

 

Die Spezifität der Bindung der beiden Stränge aneinander ist sehr hoch. Schon eine nicht komplementäre Base in einhundert Basen setzt die Stabilität des Doppelstrangs messbar herab. Man kann sich die Hybridisierungsreaktion (Bildung eines Doppelstrangs aus zwei Einzelsträngen) zunutze machen, indem man einen der beiden Stränge als Sonde verwendet, mit der man den passenden, komplementären Strang nachweist. Im Gegensatz zur Polymerasekettenreaktion braucht man die Basensequenz der Sonde oder des gesuchten Abschnitts nicht zu kennen.

 

Ein Beispiel aus der Praxis soll dies verdeutlichen: DNA-Sonden werden verwendet, um in einer Lebensmittelprobe festzustellen, aus welchen Tieren oder Pflanzen das Lebensmittel hergestellt wurde. Der Nachweis ist quantitativ, man kann also feststellen, welche Anteile der jeweiligen Tier- oder Pflanzenarten in der Probe enthalten sind.

 

Die Arten unterscheiden sich in ihrer DNA so weit, dass mit der entsprechenden Sonde selbst nahe verwandte Arten wie Schaf und Ziege unterschieden werden können.

 

Southern-Hybridisierung

 

Eine besonders häufig verwendete Art der Hybridisierung ist die von Ed Southern 1975 erfundene und nach ihm benannte Southern-Hybridisierung oder Southern-Analyse. Die Southern-Analyse wird dazu eingesetzt, Gene oder andere spezifische DNA-Abschnitte zu analysieren, ohne sie aus der gesamten DNA eines Genoms isolieren zu müssen. Bei der Southern-Analyse werden im Prinzip zwei Analyseverfahren in intelligenter Weise miteinander verknüpft. Die Hybridisierung wird eingesetzt, um ganz bestimmte DNA-Sequenzen nachzuweisen. Dieser Nachweis spezifischer DNA-Sequenzen wird mit der Restriktionsanalyse kombiniert. Bei der Restriktionsanalyse wird eine DNA mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen geschnitten. Dabei wird die DNA in kleine Fragmente zerlegt, wobei das Fragmentmuster sehr spezifisch für das eingesetzte DNA-Molekül ist. An diesem Fragmentmuster lässt sich die DNA eindeutig erkennen.

 

Das Fragmentmuster lässt sich am besten darstellen, indem das Fragmentgemisch auf einem Gel (meistens wird dazu Agarose verwendet) elektrophoretisch aufgetrennt und die DNA anschließend (zum Beispiel mit dem Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid) angefärbt wird. Betrachtet man das Gel unter UV-Licht, erscheinen die einzelnen Fragmente als eine Reihe von hell leuchtenden Banden. Je größer (komplexer) die in der Restriktionsanalyse eingesetzte DNA ist, umso mehr Banden sind im Gel zu sehen. Nach der Auftrennung erfolgt die Hybridisierung mithilfe einer radioaktiven Sonde.

 

Während zum Beispiel bei dem nur circa 5000 Basen langen Genom des Bakteriophagen ΦX174 nur relativ wenige Banden zu sehen sind, erscheinen bei dem 48 502 Basen langen Bakteriophagen Lambda schon viel mehr Banden. Bei Escherichia-coli-DNA (4,6 Millionen Basen) und bei der Bäckerhefe (12,5 Millionen Basen) sind einzelne Banden nur noch zu erahnen. Verdaut man mit dem gleichen Restriktionsenzym menschliche DNA (3 Milliarden Basen), so sind überhaupt keine einzelnen Banden mehr zu erkennen, weil es zu viele sind, um noch getrennt wahrgenommen zu werden.

 

Wir hatten oben festgestellt, dass das Restriktionsmuster ganz charakteristisch für einen DNA-Abschnitt ist. Änderungen in diesem Muster zeigen, dass sich die DNA verändert hat. Auf diese Weise erkennt man beispielsweise manche Mutationen in Patienten-DNA. Dies ist bei der molekularen Diagnostik von Erbkrankheiten oder dem genetischen Fingerabdruck von sehr großem Wert.

 

Kolonie-/Plaquefilterhybridisierung

 

Die für die Gen-/DNA-Klonierung wohl bedeutendste Hybridisierungstechnik ist die Kolonie- oder Plaquefilterhybridisierung. Um die Bedeutung dieses Hybridisierungsverfahrens richtig einschätzen zu können, soll zunächst erklärt werden, was eine Genbibliothek/Genbank ist und wie Genbibliotheken zur Klonierung von neuen Genen eingesetzt werden. Bei Genbibliotheken oder Genbanken handelt es sich um große Sammlungen von Bakterienstämmen, die viele oder alle Gene eines anderen Organismus enthalten. In einer unsortierten Genbank/Genbibliothek sind die Bakterienstämme alle gemischt. Diese Bakterienmischung enthält zwar jedes Gen eines speziellen Organismus, es ist aber nicht ohne weiteres möglich, den Klon, der ein bestimmtes Gen enthält, aus der Mischung herauszusuchen.

 

Eine Genbank enthält viele Millionen Klone, die sich alle zusammen in demselben Reagenzglas befinden. Wie gelingt es nun dem Gentechnologen, ein bestimmtes Gen oder einen speziellen DNA-Abschnitt aus diesem Gemisch von Einzelklonen herauszufischen? Die Suche nach einem speziellen Gen in einer unsortierten Genbank gleicht der sprichwörtlichen Suche nach der Stecknadel im Heuhaufen. Bei dieser Suche spielt die Hybridisierung mittels radioaktiv markierter DNA oder RNA wiederum eine ganz entscheidende Rolle.

 

Eine Chance, ein spezielles Gen in Millionen von Klonen einer Genbank zu finden, gibt es nur, wenn eine entsprechende Suchstrategie (ein Screening-Verfahren) angewendet wird.

 

Das häufigste Suchverfahren ist das Kolonie- oder Plaquefilterhybridisierungsverfahren. Bei diesem Hybridisierungsverfahren werden alle Bakterienklone einer Genbank auf zwei Filtermembranen übertragen und so angeordnet, dass zwei identische Membranen, Replikafilter entstehen. Beide Filter werden auf Nähragar aufgelegt und bebrütet. Dabei wachsen die Bakterienklone zu kleinen Kolonien heran. Einer der beiden Filter wird dann im Kühlschrank aufbewahrt, wobei die Bakterien über viele Monate am Leben bleiben. Mit dem anderen Filter wird eine Hybridisierung durchgeführt. Mit dieser Hybridisierung wird festgestellt, ob in einer Bakterienkolonie das gesuchte Gen/die gesuchte DNA enthalten ist. Natürlich ist dazu eine DNA-Sonde notwendig. Ist ein Klon beziehungsweise seine Position auf dem Filter auf diese Weise identifiziert, so kann von dem Replikafilter die entsprechende, noch lebende Bakterienkolonie identifiziert und ein Bakterienstamm angelegt werden.

 

Für die gentechnisch wichtigsten Organismen wie Mensch, Maus, Taufliege und andere bieten inzwischen Firmen oder Ressourcenzentren auf Filtern vorbereitete (gespottete) Genbanken an, die einen schnellen Zugriff auf entsprechende Klone erlauben. Die Herstellung dieser Filter übernehmen im Allgemeinen Automaten, sodass nahezu beliebig viele Replikate kostengünstig erzeugt werden können.

 

Eine spezielle, aber trotzdem sehr wichtige Anwendung der Kolonie-/Plaquefilterhybridisierung ist die Chromosomenwanderung. Die Chromosomenwanderung ist ein Verfahren, mit dem man von einem DNA-Klon ausgehend eine Serie von jeweils benachbarten Klonen isoliert, die zusammengenommen die gesamte DNA eines ganzen Chromosoms ergeben.

 

Das Prinzip ist denkbar einfach: Mit dem Ende eines klonierten DNA-Fragments als Sonde werden mithilfe der Koloniefilterhybridisierung aus einer Genbank alle hybridisierenden Klone herausgefischt.

 

Dabei gibt es DNA-Klone, deren DNA-Kette über das Ende des Ausgangsklons hinausragen. Nimmt man wiederum von einem solchen Klon das Ende als Sonde, bekommt man die nächste Gruppe von Klonen, die jeweils wieder über dieses Klonende hinausragen. Diese Schritte werden mehrfach wiederholt und man erhält so eine kontinuierliche Folge von DNA-Klonen, aus denen stückweise der ursprüngliche, kontinuierliche DNA-Faden wieder hergestellt wird. Aus einer unsortierten Genbibliothek wird dadurch eine sortierte Bibliothek.

 

Die verschiedenen DNA-/RNA-Hybridisierungsverfahren sind für die Gentechnologie sehr wichtig. Voraussetzung ist aber, dass eine Sonden-DNA vorhanden ist. Diese Sonden-DNA muss für die Auswertung eines Hybridisierungsexperiments möglichst leicht nachweisbar, mithin markiert sein. Zur Markierung von Nukleinsäuremolekülen steht eine ganze Reihe von Verfahren zur Verfügung, die unterschiedliche Vor- und Nachteile haben.

 

Markierungstechniken

 

Die älteste und immer noch benutzte Markierungstechnik ist der Einbau radioaktiver Nuklide in die DNA/RNA. Schon vor dem Beginn der Gentechnologie war es möglich, in vitro DNA/RNA enzymatisch zu synthetisieren und dabei radioaktiv markierte Bausteine in die DNA/RNA einzubauen. Prinzipiell kommen dafür alle chemischen Elemente infrage, die in der DNA enthalten sind (Phosphor, Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff; anstelle von Sauerstoff kann sogar Schwefel eingebaut werden). Die am häufigsten eingesetzten Isotope sind Phosphor-32, Schwefel-35 und Tritium (überschwerer Wasserstoff, der im Kern neben dem einen Proton noch zwei Neutronen enthält). Diese Isotope sind Betastrahler. Die Betastrahlung (Elektronenstrahlung) lässt sich besonders bei Phosphor-32 sehr leicht nachweisen. Dies geschieht mit einem Röntgenfilm, der durch die Betastrahlung geschwärzt wird.

 

In vielen Laboratorien ist der Umgang mit radioaktiven Stoffen nicht erwünscht (zu gefährlich, zu umständlich und bei der Entsorgung zu teuer). Deshalb gab es schon früh den Wunsch nach alternativen Markierungsverfahren, von denen heute eine Vielzahl existiert. Die meisten nicht radioaktiven Markierungsverfahren verwenden entweder Fluoreszenzfarbstoffe oder Antikörper zum Nachweis. Bei der Fluoreszenzmarkierung von DNA/RNA werden Fluoreszenzfarbstoffe (wie Fluorescein oder Rhodamin) an die Basen der DNA gebunden.

 

Die fluoreszenzmarkierten Nukleinsäuren lassen sich mit hoher Empfindlichkeit nachweisen, indem mit einem Anregungslicht (meist UV-Licht) der Fluoreszenzfarbstoff zum Leuchten gebracht wird. Diese Markierungsverfahren werden vor allem bei der Online-Sequenzierung und bei der Fluoreszenz In-situ-Hybridisierung eingesetzt. Andere nicht radioaktive Markierungsverfahren beruhen auf der Bindung von solchen Molekülen an die DNA-Basen, gegen die sich Antikörper erzeugen lassen. Zwei typische Moleküle dieser Art sind das Biotin und das Digoxigenin. Das in die DNA eingebaute Biotin oder Digoxigenin wird über einen spezifischen Anti-Biotin- oder Anti-Digoxigenin-Antikörper nachgewiesen.

 

Die nicht radioaktiven Markierungsverfahren haben inzwischen einen technischen Stand erreicht, der dem der radioaktiven Markierungsverfahren entspricht (oder ihn übertrifft). Deshalb gehen immer mehr Laboratorien auf diese weniger gefährlichen und die Umwelt nicht belastenden Verfahren über. Einige dieser Verfahren sind patentiert, sodass sie exklusiv von bestimmten Firmen angeboten werden. Insgesamt ist die Auswahl der Verfahren zur Markierung von Nukleinsäuren sehr groß, und es findet sich fast für jeden Zweck ein geeignetes Verfahren.

 

 DNA-Chip-Technologie

 

Eine aufregende Neuentwicklung bahnt sich in der Gentechnologie durch die Kombination von Computertechnologie, Mikro- und Nanotechnologie sowie der Bioinformatik an. Die zunehmende Menge an DNA-Sequenzinformation aus Genomprojekten erlaubt es, eine völlig neue Gen-Analysemethode zu entwickeln. Deren Leistungsfähigkeit wird um Größenordnungen die Leistungsfähigkeit und Geschwindigkeit der bisherigen Sequenzierverfahren übertreffen. Es handelt sich um die DNA-Chip-Technologie. Dabei werden auf kleinstem Raum auf einem Chip aus Glas Hunderttausende bis Millionen verschiedener kurzer DNA-Fragmente (Oligonukleotide) untergebracht. Diese etwa 20 Basen langen Oligonukleotide dienen als Hybridisierungssonden für Gene oder andere Nukleinsäuren. Nach dem Prinzip der Hybridisierung wird jedes dieser Oligonukleotide aus einem Gemisch von verschiedenen DNAs mit einem passenden Fragment einen stabilen Doppelstrang bilden. Die zu analysierende DNA/RNA wird sozusagen von den Hunderttausenden Sonden auf dem Chip nach passenden DNA-Sequenzen abgesucht. Passende DNA-Fragmente binden an denjenigen Positionen, an denen das entsprechende Oligonukleotid, die Sonde, auf dem Chip platziert ist. Der Nachweis erfolgt über Fluoreszenzmarkierung, die vor der Analyse in die zu untersuchende DNA eingebaut wird.

 

Das Ergebnis der Hybridisierung eines DNA-Chips wird nicht mehr manuell ausgewertet, sondern mithilfe einer hoch empfindlichen, mit einem Computer verbundenen Digitalkamera. Der Computer analysiert die Verteilung leuchtender und dunkler Positionen und errechnet daraus, welche DNA-Sequenzen in der Test-DNA vorhanden beziehungsweise nicht vorhanden sind.

 

Die Leistungsfähigkeit dieser DNA-Chips ist beeindruckend. So konnten inzwischen Chips hergestellt werden, die alle 6500 Gene der Bäckerhefe als Sonden enthielten. Mit diesem Chip lässt sich innerhalb von wenigen Stunden feststellen, welche der 6500 Gene zu einem bestimmten Zeitpunkt aktiv sind. Erstaunlich ist auch die Genauigkeit, mit der diese DNA-Chips Basensequenzen in der Test-DNA erkennen. Ein DNA-Chip ist ohne weiteres in der Lage, zwischen DNA-Molekülen zu unterscheiden, die nur eine einzige unterschiedliche Base aufweisen. Das bedeutet, dass mithilfe eines entsprechend konstruierten DNA-Chips in Tausenden von Genen gleichzeitig nach Mutationen gesucht werden kann. Die Chiptechnologie ist in der Lage, letztlich jede Abweichung in der Basensequenz in Tausenden von Genen in weniger als einem Tag zu bestimmen. Voraussetzung dafür ist allerdings, dass zuvor wenigstens einmal die Basensequenz der zu untersuchenden DNA bestimmt wurde.

 

Unter diesem Aspekt ist vor allem das Humangenomprojekt von ganz besonderem Interesse. Sind einmal alle Gene des Menschen in ihrer Basensequenz bekannt, so ist es möglich, den Menschen-Gen-Chip zu produzieren. Mit einem solchen Humangenom-Chip ließen sich die kleinen genetischen Unterschiede zwischen Tausenden von Menschen kostengünstig feststellen. Damit wäre es in der Tat vorstellbar, auch sehr komplexe genetisch bedingte Eigenschaften und Krankheiten bestimmten Genen oder Allelen zuzuordnen.

 

Für die Behandlung genetischer Erkrankungen könnte sich durch die Chiptechnologie eine wirkliche Revolution anbahnen: Vor Beginn der Therapie könnte für jeden Patienten mithilfe eines Chips festgestellt werden, welcher genetische Defekt als Ursache infrage kommt. Anhand des Ergebnisses erhielte jeder Patient die individuell auf seine spezifische Erkrankung zugeschnittene Therapie. Fachleute gehen heute schon davon aus, dass diese gezielte Individualtherapie nicht nur Behandlungskosten in der Größenordnung zwischen 70 und 90 Prozent senken würde, sondern dass sie auch für viele Patienten eine große Verbesserung bringen würde: Mehr als die Hälfte der Patienten würde nicht mehr überflüssigerweise unter den zum Teil drastischen Nebenwirkungen einer unwirksamen, weil für die Krankheitsursache falschen Therapie leiden müssen.

 

Prof. Dr. Erwin Schmidt

 

Grundlegende Informationen finden Sie unter:

 

Gentechnik: DNA-Synthese und PCR

 

Literatur:

 

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Biotechnologie - Gentechnik. Eine Chance für neue Industrien, herausgegeben von Thomas von Schell und Hans Mohr. Berlin u. a. 1995.

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 Brown, Terence A.: Gentechnologie für Einsteiger. Aus dem Englischen. Heidelberg²1996. Nachdruck Heidelberg 1999.

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 Darling, David C. / Brickell, Paul M.: Nucleinsäure-Blotting. Aus dem Englischen. Heidelberg u. a. 1996.

 

Gentechnik. Einführung in Prinzipien und Methoden, herausgegeben von Hans Günter Gassen und Klaus Minol. Stuttgart u. a. ⁴1996.

 

Gentechnische Methoden. Eine Sammlung von Arbeitsanleitungen für das molekularbiologische Labor, herausgegeben von Hans Günter Gassen und Gangolf Schrimpf. Heidelberg u. a. ²1999.

 Glick, Bernard R. / Pasternak, Jack J.: Molekulare Biotechnologie. Aus dem Englischen. Heidelberg u. a. 1995.

 Ibelgaufts, Horst: Gentechnologie von A bis Z. Studienausgabe Weinheim u. a. 1990. Nachdruck Weinheim u. a. 1993.

 Nicholl, Desmond S.: Gentechnische Methoden.Aus dem Englischen. Heidelberg u. a. 1995.

 Winnacker, Ernst-Ludwig: Gene und Klone. Eine Einführung in die Gentechnologie. Weinheim u. a. 1984. Veränderter Nachdruck Weinheim u. a. 1990.